雖然熒光探針（引物）不斷有新的技術(shù)出現(xiàn)，但是作為一種經(jīng)典的
定量PCR儀技術(shù)，探針技術(shù)仍然是許多實(shí)驗(yàn)研究人員進(jìn)行定量檢測(cè)的，這主要是因?yàn)橄鄬?duì)于熒光染料，探針具有序列特異性，只結(jié)合到互補(bǔ)區(qū)，而且熒光信號(hào)與擴(kuò)增的拷貝數(shù)具有對(duì)應(yīng)的關(guān)系，因此特異性強(qiáng)靈敏度高，而且條件優(yōu)化容易；而相對(duì)于雜交探針，探針只要設(shè)計(jì)一條探針，因此探針設(shè)計(jì)較便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR儀要求。當(dāng)然定量方法由于還是要合成探針，也給實(shí)驗(yàn)操作帶來了挑戰(zhàn)。
一般定量PCR儀實(shí)驗(yàn)過程為：目的基因查找比對(duì)→探針與引物設(shè)計(jì)→探針與引物合成→配置反應(yīng)體系→反應(yīng)參數(shù)→重復(fù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化條件→獲得曲線數(shù)據(jù)，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線→再重復(fù)驗(yàn)證。
總體原則：
先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近探針。
所選序列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有小二級(jí)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段—這是因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響反應(yīng)效率，而且還會(huì)阻礙酶的擴(kuò)增。建議先進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)，如果不能避免二級(jí)結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度。
為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G）。
將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。
探針位置盡可能地靠近上游引物。
定量PCR儀檢測(cè)探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)。
整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量—G含量高會(huì)降低反應(yīng)效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針。
為確保引物探針的特異性，好將設(shè)計(jì)好的序列再核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。
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